Capire come i medici identificano l’iperespressione della fusione di geni NTRK è fondamentale per i pazienti che potrebbero beneficiare di opzioni terapeutiche specializzate. Quando un frammento di cromosoma che trasporta un gene NTRK si rompe e si unisce a un altro gene, si crea una fusione anomala che può favorire la crescita del cancro. Scoprire questa alterazione attraverso test appropriati può aprire le porte a terapie mirate che potrebbero non essere disponibili attraverso gli esami oncologici standard.

Chi Dovrebbe Considerare il Test per le Fusioni NTRK

Chiunque riceva una diagnosi di cancro potrebbe potenzialmente avere una fusione del gene NTRK, che si verifica quando parte di un gene NTRK si collega erroneamente a un gene non correlato. Questo crea un manuale di istruzioni anomalo che dice alle cellule di crescere in modo incontrollato. Sebbene questa alterazione si trovi in meno di un caso su cento di tumori in generale, alcuni tipi di tumore rari mostrano questa fusione con frequenza molto maggiore.^[1]

Il test diventa particolarmente importante per le persone con diagnosi di tumori rari specifici in cui le fusioni NTRK compaiono in oltre l’80 percento dei casi. Questi includono il fibrosarcoma infantile nei bambini piccoli, il carcinoma mammario secretorio e il carcinoma secretorio analogo mammario della ghiandola salivare. Per questi pazienti, l’identificazione della fusione è quasi attesa e dovrebbe far parte della valutazione diagnostica di routine.^[13]

Tuttavia, le fusioni NTRK si verificano anche in numeri più piccoli attraverso molti tipi di cancro comuni. Le persone con carcinoma polmonare non a piccole cellule, cancro del colon-retto, sarcoma, cancro alla tiroide, tumori cerebrali e vari altri tumori solidi possono presentare questa fusione anche quando il loro cancro appare tipico.^[1][11] La sfida è che questi pazienti potrebbero non essere mai testati perché i medici spesso non pensano di cercare alterazioni così rare.

I pazienti i cui tumori sono progrediti nonostante i trattamenti standard dovrebbero considerare seriamente test completi che includano il rilevamento della fusione NTRK. Quando le terapie convenzionali smettono di funzionare, trovare una fusione targetizzabile come NTRK può fornire nuove vie di trattamento. Questo è particolarmente prezioso per le persone con malattia avanzata o metastatica che necessitano di opzioni aggiuntive oltre alla chemioterapia.^[8]

I bambini con cancro meritano una considerazione speciale per il test delle fusioni NTRK. Alcuni tumori infantili mostrano tassi più elevati di queste fusioni e i trattamenti mirati hanno dimostrato un’efficacia notevole nei pazienti giovani. Poiché queste terapie generalmente causano meno effetti collaterali rispetto alla chemioterapia tradizionale, identificare i bambini eleggibili diventa ancora più importante per la loro qualità di vita durante il trattamento.^[10]

È consigliabile richiedere il test quando viene diagnosticato un tipo di cancro noto per ospitare occasionalmente fusioni NTRK, quando il cancro si diffonde nonostante il trattamento, o quando si è ricoverati in una struttura che offre profilazione molecolare completa. Considerazioni economiche e accesso alle strutture di test possono influenzare quando e come viene effettuato il test, ma il potenziale di scoprire una fusione trattabile rende lo sforzo utile per molti pazienti.^[3]

Metodi Diagnostici Standard per il Rilevamento delle Fusioni NTRK

Diverse tecniche di laboratorio possono rilevare le fusioni del gene NTRK, ciascuna con punti di forza e limitazioni distinte. Comprendere questi metodi aiuta i pazienti a capire cosa stanno cercando i loro medici e perché alcuni test potrebbero essere raccomandati rispetto ad altri. La scelta del metodo di test dipende spesso da ciò che è disponibile in una particolare struttura medica, dal costo e dalla quantità di tessuto tumorale disponibile per l’analisi.^[3]

Test di Immunoistochimica

L’immunoistochimica, spesso abbreviata in IHC, è tipicamente il primo test di screening utilizzato per cercare fusioni NTRK. Questo metodo esamina sezioni sottili di tessuto tumorale al microscopio dopo aver applicato anticorpi speciali che si attaccano alle proteine TRK. Quando si verifica una fusione NTRK, le cellule spesso producono quantità anormalmente elevate di proteina TRK, che gli anticorpi possono rilevare creando un cambiamento di colore visibile nel tessuto.^[3]

Il principale vantaggio del test IHC è che è relativamente economico e ampiamente disponibile nella maggior parte dei laboratori di patologia. I risultati tornano tipicamente entro pochi giorni, rendendolo un primo passo pratico. Tuttavia, l’IHC ha importanti limitazioni. Può talvolta mostrare risultati positivi anche quando non esiste alcuna fusione genica reale, perché alcuni tumori producono naturalmente alti livelli di proteina TRK per altri motivi. Ciò significa che un risultato IHC positivo deve sempre essere confermato con test aggiuntivi per verificare che sia presente una fusione reale.^[3]

Al contrario, l’IHC può occasionalmente mancare fusioni reali se il tumore non produce abbastanza proteina per essere rilevata. Nonostante queste limitazioni, l’IHC serve come strumento di screening utile e conveniente. Quando l’IHC mostra una possibile fusione, i medici passano a metodi di test più definitivi per confermare il risultato.^[5]

Ibridazione Fluorescente In Situ

L’ibridazione fluorescente in situ, nota come FISH, utilizza sonde fluorescenti che si attaccano a geni specifici sui cromosomi. Quando visualizzate al microscopio speciale, queste sonde si illuminano con colori diversi. Se un gene NTRK si è rotto e fuso con un altro gene, il normale schema di segnali fluorescenti appare interrotto, rivelando il riarrangiamento.^[3]

Il test FISH fornisce prove visive dirette del riarrangiamento genico e può confermare se si sono verificate rotture cromosomiche nella regione NTRK. Questo lo rende più affidabile dell’IHC per verificare le fusioni. Tuttavia, FISH richiede sonde specifiche progettate per ciascuno dei tre geni NTRK e non può identificare quale gene partner si è unito a NTRK. Conoscere il gene partner può talvolta essere importante per capire come si comporta il cancro o per selezionare trattamenti specifici.^[5]

Inoltre, il test FISH richiede tessuto tumorale di alta qualità e attrezzature specializzate che potrebbero non essere disponibili in tutte le strutture. La tecnica funziona meglio quando i medici sospettano già una fusione NTRK basata su test di screening precedenti. Mentre FISH conferma che il riarrangiamento si è verificato, non fornisce i dettagli genetici completi che alcuni metodi di test più recenti possono rivelare.^[3]

Sequenziamento di Nuova Generazione Basato su DNA

Il sequenziamento di nuova generazione, abbreviato in NGS, rappresenta un approccio più completo che analizza molti geni simultaneamente. L’NGS basato su DNA legge attraverso il codice genetico delle cellule tumorali cercando varie mutazioni, incluse le fusioni geniche. Questo metodo può esaminare dozzine o persino centinaia di geni correlati al cancro in un singolo test, fornendo un quadro completo della composizione genetica di un tumore.^[3]

La forza dell’NGS basato su DNA risiede nella sua capacità di identificare non solo le fusioni NTRK ma anche altri cambiamenti genetici potenzialmente targetizzabili. Per i pazienti i cui tumori mancano di fusioni NTRK, lo stesso test potrebbe rivelare diverse anomalie che potrebbero guidare le decisioni terapeutiche. Questo approccio completo massimizza il valore del tessuto tumorale limitato, che è particolarmente importante quando le biopsie producono campioni piccoli.^[13]

Tuttavia, l’NGS basato su DNA ha una limitazione significativa quando si tratta di rilevare fusioni geniche. Mentre eccelle nel trovare mutazioni puntiformi—singole modifiche di lettera nel codice genetico—talvolta fatica a identificare riarrangiamenti complessi dove grandi pezzi di cromosomi scambiano posizioni. A seconda di come viene eseguito e analizzato il sequenziamento, alcune fusioni potrebbero essere mancate, in particolare se i punti di rottura si verificano in posizioni insolite.^[3]

Sequenziamento di Nuova Generazione Basato su RNA

L’NGS basato su RNA offre il metodo più affidabile per rilevare le fusioni del gene NTRK. Invece di leggere il manuale di istruzioni del DNA stesso, questa tecnica esamina l’RNA, che è la copia attiva che le cellule creano quando usano effettivamente i geni. Quando esiste un gene di fusione, le cellule creano RNA di fusione che combina sequenze di entrambi i geni partner, e il sequenziamento basato su RNA può rilevare questa combinazione anomala in modo molto efficace.^[3]

Questo approccio identifica sia il gene NTRK coinvolto che il suo gene partner, fornendo informazioni complete sulla fusione. Può rilevare fusioni indipendentemente da dove si è verificata la rottura cromosomica o quanto complesso possa essere il riarrangiamento. L’NGS basato su RNA tende anche ad essere più sensibile dei metodi basati su DNA, il che significa che può trovare fusioni anche quando sono presenti solo in una porzione delle cellule tumorali.^[3]

Il principale svantaggio del sequenziamento basato su RNA è che richiede tessuto tumorale molto ben conservato. Le molecole di RNA sono fragili e si rompono rapidamente dopo che il tessuto viene rimosso dal corpo. Se i campioni tumorali sono vecchi o non sono stati gestiti correttamente, l’RNA potrebbe essere troppo degradato per un test accurato. Inoltre, il sequenziamento RNA è generalmente più costoso di altri metodi e potrebbe non essere disponibile in tutte le strutture di test.^[14]

Reazione a Catena della Polimerasi con Trascrittasi Inversa

La reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa, chiamata RT-PCR, è un altro metodo basato su RNA che cerca specificamente combinazioni di fusione note. Questa tecnica fa molte copie di materiale genetico dalle fusioni sospette, amplificandole abbastanza da essere facilmente rilevate. La RT-PCR funziona bene quando i medici sanno quali fusioni specifiche cercare in base al tipo di cancro testato.^[5]

La RT-PCR può essere altamente sensibile e specifica quando si prendono di mira partner di fusione noti. Tuttavia, richiede la progettazione di test specifici per ogni possibile combinazione di fusione. Poiché i geni NTRK possono fondersi con dozzine di diversi geni partner, la RT-PCR non può servire come strumento di screening universale. Funziona meglio per i tumori in cui certi partner di fusione si verificano comunemente, come la fusione ETV6-NTRK3 nel fibrosarcoma congenito.^[5]

Biopsia Liquida e DNA Tumorale Circolante

Il test basato sul sangue, spesso chiamato biopsia liquida, rappresenta un approccio emergente che analizza frammenti di DNA tumorale che fluttuano nel flusso sanguigno. Quando le cellule tumorali muoiono, rilasciano il loro DNA nel sangue, dove test specializzati possono rilevarlo. Questo DNA tumorale circolante, o ctDNA, può contenere fusioni NTRK se sono presenti nel cancro.^[4]

La biopsia liquida offre vantaggi significativi perché richiede solo un prelievo di sangue piuttosto che una biopsia tissutale. Questo rende il test meno invasivo e consente campionamenti ripetuti per monitorare come i tumori cambiano nel tempo. I pazienti che non possono sottoporsi in sicurezza a biopsia tissutale a causa della posizione del tumore o dello stato di salute possono comunque accedere ai test attraverso campioni di sangue.^[14]

Tuttavia, la biopsia liquida ha importanti limitazioni per il rilevamento delle fusioni NTRK. La quantità di DNA tumorale nel sangue varia notevolmente tra pazienti e tipi di tumore. Alcuni tumori rilasciano molto poco DNA in circolazione, rendendoli difficili o impossibili da rilevare attraverso il test del sangue. Inoltre, la biopsia liquida può mancare fusioni che il test tissutale troverebbe. In almeno un caso documentato, il test tissutale ha rivelato una fusione NTRK che era completamente assente nel test del sangue del paziente eseguito nello stesso periodo.^[4]

Approcci di Test per l’Arruolamento in Studi Clinici

Quando i pazienti considerano di partecipare a studi clinici che studiano tumori NTRK-fusione positivi o testano nuovi trattamenti, i requisiti diagnostici spesso diventano più rigorosi rispetto a quelli utilizzati nell’assistenza clinica di routine. Gli studi clinici necessitano di risultati di test altamente accurati e riproducibili per garantire che i pazienti arruolati abbiano veramente le alterazioni genetiche studiate. Comprendere questi requisiti aiuta i pazienti a prepararsi per il processo di test e sapere cosa aspettarsi.^[8]

La maggior parte degli studi clinici che indagano trattamenti per tumori NTRK-fusione positivi richiedono una conferma definitiva della fusione attraverso il sequenziamento di nuova generazione. Mentre l’immunoistochimica potrebbe servire come strumento di screening iniziale nella pratica clinica, gli studi richiedono tipicamente la conferma NGS perché questo metodo fornisce le informazioni più dettagliate sulla fusione specifica presente. Il test deve identificare quale gene NTRK è coinvolto (NTRK1, NTRK2 o NTRK3) e quale gene partner si è fuso con esso.^[8]

Gli sponsor degli studi spesso specificano quali piattaforme di test o laboratori sono accettabili per confermare lo stato della fusione NTRK. Alcuni studi richiedono che i test siano eseguiti presso laboratori centrali designati che sono stati validati per lo studio specifico. Questo garantisce la standardizzazione tra tutti i partecipanti ed elimina la variabilità che potrebbe derivare da diverse strutture di test che utilizzano metodi diversi o interpretano i risultati in modo diverso.^[6]

La qualità e la quantità del tessuto tumorale sottoposto a test contano molto nel contesto dello studio. Gli studi clinici richiedono tipicamente che i campioni tumorali soddisfino standard minimi per la percentuale di cellule tumorali—il che significa che devono essere presenti abbastanza cellule tumorali effettive nella biopsia rispetto al tessuto normale. Se una biopsia contiene principalmente cellule normali con solo poche cellule tumorali sparse, il segnale genetico dalla fusione potrebbe essere troppo debole per essere rilevato in modo affidabile. Le biopsie fresche spesso forniscono materiale di migliore qualità rispetto al tessuto archiviato che è stato conservato per mesi o anni.^[3]

Alcuni studi che studiano farmaci che prendono di mira le fusioni NTRK includono pazienti che sono “naive agli inibitori TRK”, il che significa che non hanno mai ricevuto un trattamento specificamente mirato alla fusione. Questi studi possono richiedere documentazione che i trattamenti precedenti non includessero inibitori TRK e possono persino richiedere test per confermare che il tumore non abbia sviluppato mutazioni di resistenza. Questo garantisce che le risposte osservate riflettano veramente l’attività del farmaco contro le fusioni NTRK naive al trattamento.^[8]

Gli studi clinici possono anche imporre test aggiuntivi oltre al rilevamento della fusione NTRK per caratterizzare il tumore più completamente. Questo può includere la valutazione di altre mutazioni genetiche, la misurazione del carico mutazionale tumorale (quante mutazioni esistono nell’intero genoma del cancro) o la valutazione di marcatori correlati all’attività del sistema immunitario. Questi test aggiuntivi aiutano i ricercatori a capire non solo se i pazienti rispondono al trattamento, ma anche perché alcuni rispondono meglio di altri.^[13]

Il momento del test rispetto all’arruolamento nello studio può essere critico. Alcuni studi accettano risultati di test eseguiti mesi o persino anni prima dell’arruolamento, mentre altri richiedono test freschi poco prima che i pazienti inizino il trattamento. Quando i tumori progrediscono o ricevono terapie intermedie, la loro composizione genetica può cambiare. Una fusione presente alla diagnosi iniziale potrebbe non guidare più la crescita del cancro dopo multiple linee di trattamento, o potrebbero essere emersi nuovi meccanismi di resistenza.^[11]

Per i pazienti i cui test diagnostici iniziali non includevano un’analisi completa della fusione NTRK, gli studi clinici possono organizzare e coprire il costo dei test appropriati come parte delle procedure di screening. Questo consente ai pazienti che altrimenti non avrebbero accesso a costosi test di sequenziamento di determinare la loro eleggibilità. Tuttavia, questo processo di screening può richiedere diverse settimane, il che può essere impegnativo per i pazienti con malattia in rapida progressione che necessitano di iniziare il trattamento rapidamente.^[10]

I requisiti di documentazione per l’arruolamento negli studi clinici si estendono oltre il semplice risultato del test stesso. Gli studi richiedono tipicamente il rapporto patologico completo che descrive il tipo e le caratteristiche del tumore, il rapporto dettagliato del test che mostra esattamente quale fusione è stata rilevata e quale metodologia è stata utilizzata, e la conferma che il campione testato provenisse effettivamente dal paziente arruolato. Questo tracciato cartaceo, sebbene talvolta noioso, protegge sia i pazienti che i ricercatori garantendo l’accuratezza.^[6]

Alcuni studi specializzati si concentrano specificamente su partner di fusione rari o configurazioni di fusione insolite. Questi studi potrebbero escludere pazienti con combinazioni di fusione comuni che sono già state ben studiate, cercando invece di capire come diversi partner di fusione influenzano la risposta al trattamento. Tali studi richiedono una caratterizzazione molto dettagliata della fusione, spesso richiedendo dati di sequenziamento RNA che mappano precisamente dove si sono verificate la rottura e la fusione.^[13]