La diagnostica del cancro con instabilità dei microsatelliti prevede test specializzati per rilevare cambiamenti nel DNA delle cellule tumorali. Questi esami aiutano i medici a comprendere le caratteristiche genetiche di un tumore, orientare le decisioni terapeutiche e identificare i pazienti che potrebbero beneficiare di determinate terapie. Capire quando e come vengono eseguiti questi test può permettere ai pazienti di partecipare in modo più consapevole al proprio percorso di cura.

Introduzione: Chi Dovrebbe Sottoporsi alla Diagnostica

Non tutti i pazienti con cancro hanno bisogno di essere testati per l’instabilità dei microsatelliti, ma alcuni gruppi specifici di persone possono trarre particolare beneficio da questa valutazione diagnostica. Il test è particolarmente importante per le persone con diagnosi di cancro del colon-retto, poiché circa il 15-20 percento di questi tumori mostra alta instabilità dei microsatelliti.^[3] Questa percentuale è sufficientemente significativa che molte linee guida mediche ora raccomandano il test per tutti i pazienti con cancro del colon-retto, indipendentemente dall’età o dalla storia familiare.

Oltre al cancro del colon-retto, il test per l’instabilità dei microsatelliti è consigliabile anche per i pazienti con cancro dell’endometrio, cancro gastrico e alcuni altri tumori gastrointestinali. Circa un cancro dell’endometrio su tre e uno su sette dei tumori del colon-retto, dello stomaco e delle ovaie mostrano alta instabilità dei microsatelliti.^[14] La presenza di questa caratteristica genetica può influenzare significativamente quali trattamenti funzionano meglio, rendendo l’identificazione precoce cruciale per una cura ottimale.

Le persone che hanno una storia familiare di cancro, specialmente se diversi parenti hanno ricevuto una diagnosi di cancro del colon-retto o dell’endometrio in giovane età, dovrebbero discutere del test per l’instabilità dei microsatelliti con il proprio medico. Questo tipo di schema familiare potrebbe suggerire la sindrome di Lynch, una condizione ereditaria che aumenta il rischio di cancro ed è fortemente associata all’instabilità dei microsatelliti.^[8] In questi casi, il test serve a un duplice scopo: aiuta a guidare le decisioni terapeutiche immediate e può rivelare se altri membri della famiglia potrebbero beneficiare di una consulenza genetica.

I pazienti il cui cancro si è diffuso o ha dato metastasi possono essere anch’essi candidati per il test dell’instabilità dei microsatelliti, soprattutto se i trattamenti standard non sono stati efficaci. Il motivo è che i tumori con alta instabilità dei microsatelliti spesso rispondono bene a un tipo di trattamento chiamato immunoterapia, che sfrutta il sistema immunitario dell’organismo per combattere il cancro.^[9] Conoscere lo stato dei microsatelliti prima di iniziare il trattamento permette ai medici di selezionare le terapie con le maggiori probabilità di successo.

Metodi Diagnostici Classici

Esistono due approcci principali per testare l’instabilità dei microsatelliti, ciascuno con i propri punti di forza e applicazioni. Il primo metodo esamina direttamente i meccanismi di riparazione del DNA, mentre il secondo analizza le conseguenze quando questi meccanismi falliscono. Comprendere entrambi i metodi aiuta a spiegare perché i medici potrebbero sceglierne uno rispetto all’altro in situazioni diverse.

L’immunoistochimica, spesso abbreviata in IHC, è una delle tecniche più comunemente utilizzate per rilevare problemi nella riparazione del DNA. Questo test esamina il tessuto tumorale al microscopio dopo averlo trattato con coloranti speciali che si legano a proteine specifiche coinvolte nella riparazione del DNA. Il corpo umano normalmente utilizza un sistema chiamato riparazione degli errori di appaiamento, o MMR, per correggere gli errori che si verificano quando le cellule copiano il loro DNA.^[3] Il sistema di riparazione degli errori di appaiamento include diverse proteine chiave con nomi tecnici come MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Quando viene eseguito il test immunoistochimico, i patologi verificano se queste proteine sono presenti nelle cellule tumorali.

Se una o più di queste proteine di riparazione degli errori di appaiamento mancano dal tessuto tumorale, il risultato del test viene descritto come riparazione degli errori di appaiamento deficiente, o dMMR. Questo risultato suggerisce fortemente che il tumore presenta instabilità dei microsatelliti. Il vantaggio dell’immunoistochimica è che può essere eseguita relativamente rapidamente su tessuto già raccolto durante una biopsia o un intervento chirurgico di routine. La maggior parte dei laboratori di patologia è attrezzata per eseguire questi test, rendendoli ampiamente accessibili.^[7]

Il secondo importante approccio diagnostico è chiamato test dell’instabilità dei microsatelliti basato sulla reazione a catena della polimerasi, o PCR. Invece di esaminare le proteine di riparazione, questo metodo analizza direttamente i microsatelliti stessi. I microsatelliti sono brevi sequenze ripetitive di DNA sparse in tutto il genoma, tipicamente composte da uno a sei elementi costitutivi del DNA ripetuti molte volte.^[7] Queste aree sono particolarmente soggette a errori quando il sistema di riparazione degli errori di appaiamento non funziona correttamente. Pensate ai microsatelliti come a uno schema balbettante nel codice genetico: quando il sistema di riparazione fallisce, questi “balbettii” possono allungarsi o accorciarsi nelle cellule tumorali rispetto alle cellule normali della stessa persona.

Il test basato sulla PCR confronta la lunghezza di specifiche sequenze di microsatelliti tra il tessuto tumorale e il tessuto normale dello stesso paziente. I laboratori esaminano tipicamente un pannello standard di cinque marcatori di microsatelliti. In base a quanti di questi marcatori mostrano cambiamenti, i tumori vengono classificati in categorie. Se due o più dei cinque marcatori mostrano instabilità, il tumore viene designato come instabilità dei microsatelliti alta, o MSI-H. Se solo un marcatore mostra cambiamenti, viene chiamato instabilità dei microsatelliti bassa, o MSI-L. Se nessuno mostra cambiamenti, il tumore è microsatellite stabile, o MSS.^[3] Ai fini del trattamento, i tumori MSI-L e MSS sono generalmente raggruppati insieme perché si comportano in modo simile.

Più recentemente, il sequenziamento di nuova generazione, o NGS, è emerso come una terza opzione per rilevare l’instabilità dei microsatelliti. Questa tecnologia avanzata può leggere simultaneamente milioni di sequenze di DNA, fornendo una visione completa dei cambiamenti genetici in un tumore. Il sequenziamento di nuova generazione può rilevare l’instabilità dei microsatelliti identificando anche altre alterazioni genetiche che potrebbero essere rilevanti per le decisioni terapeutiche.^[7] Poiché fornisce così tante informazioni in un singolo test, l’NGS sta diventando sempre più popolare, specialmente nei centri oncologici più grandi. Tuttavia, tipicamente richiede apparecchiature e competenze più sofisticate rispetto agli altri metodi.

Ogni metodo di test ha vantaggi e limiti. L’immunoistochimica è relativamente economica e veloce, rendendola un buon test di prima linea. Può anche fornire indizi su quale specifico gene di riparazione potrebbe essere interessato, il che può essere utile se si sospetta la sindrome di Lynch. Tuttavia, in rari casi, le proteine di riparazione degli errori di appaiamento potrebbero essere presenti ma non funzionare correttamente, portando a risultati falsati. Il test basato sulla PCR misura direttamente l’instabilità genetica, fornendo una prova forte dei problemi di riparazione degli errori di appaiamento. Funziona bene anche con piccoli campioni di tessuto. Il sequenziamento di nuova generazione offre le informazioni genetiche più complete ma è più costoso e richiede più tempo.^[7]

Nella pratica, molti laboratori utilizzano l’immunoistochimica come test di screening iniziale a causa della sua convenienza e del rapporto costo-efficacia. Se i risultati non sono chiari o se sono necessarie informazioni genetiche aggiuntive, potrebbe seguire il test basato sulla PCR o il sequenziamento di nuova generazione. Alcune linee guida raccomandano di utilizzare insieme sia l’immunoistochimica che il test basato sulla PCR per massimizzare l’accuratezza.^[20] La scelta del metodo dipende spesso dalle capacità del laboratorio, dalla quantità di tessuto disponibile e da quali altre informazioni genetiche potrebbero essere necessarie per la pianificazione del trattamento.

Diagnostica per la Qualificazione agli Studi Clinici

Quando i pazienti con tumori ad alta instabilità dei microsatelliti vengono considerati per gli studi clinici, i requisiti diagnostici diventano più specifici e standardizzati. Gli studi clinici testano nuovi trattamenti o nuove combinazioni di trattamenti esistenti e richiedono metodi coerenti e affidabili per identificare quali pazienti sono idonei a partecipare. Il modo in cui viene testata l’instabilità dei microsatelliti per l’arruolamento negli studi si è evoluto man mano che la nostra comprensione della condizione è cresciuta.

La maggior parte degli studi clinici che si concentrano sui trattamenti di immunoterapia per i tumori con problemi di riparazione degli errori di appaiamento richiedono la conferma dello stato di instabilità dei microsatelliti utilizzando metodi di test validati. Gli approcci più ampiamente accettati sono l’immunoistochimica per le proteine di riparazione degli errori di appaiamento e il test dell’instabilità dei microsatelliti basato sulla PCR utilizzando pannelli di marcatori standardizzati.^[9] I protocolli degli studi specificano tipicamente quale metodo deve essere utilizzato e dove deve essere eseguito il test, poiché la coerenza tra tutti i partecipanti allo studio è essenziale per interpretare i risultati.

Per l’arruolamento basato sull’immunoistochimica, gli studi di solito richiedono il test per tutte e quattro le principali proteine di riparazione degli errori di appaiamento: MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Un tumore è considerato deficiente nella riparazione degli errori di appaiamento se una qualsiasi di queste proteine è assente dai nuclei delle cellule tumorali pur rimanendo presente nel tessuto normale circostante, che serve come controllo interno.^[8] Il test deve essere eseguito da un laboratorio certificato per soddisfare specifici standard di qualità, garantendo che i risultati siano affidabili e riproducibili.

Quando viene utilizzato il test basato sulla PCR per la qualificazione allo studio, l’analisi deve includere l’esame di almeno cinque marcatori standard di microsatelliti. Questi marcatori sono stati attentamente selezionati perché sono particolarmente sensibili alla deficienza di riparazione degli errori di appaiamento. Il test confronta il DNA estratto dal tessuto tumorale con il DNA dal tessuto normale del paziente, tipicamente ottenuto dal sangue o da tessuto non canceroso dello stesso campione bioptico.^[3] Un tumore che mostra instabilità in due o più dei cinque marcatori soddisfa i criteri per lo stato di instabilità dei microsatelliti alta e l’idoneità allo studio.

Alcuni studi clinici ora accettano i risultati del sequenziamento di nuova generazione come prova dello stato di instabilità dei microsatelliti. In questi casi, la piattaforma di sequenziamento deve essere stata validata specificamente per rilevare l’instabilità dei microsatelliti e l’analisi deve esaminare un numero sufficiente di loci di microsatelliti in tutto il genoma. Diverse piattaforme di sequenziamento utilizzano diversi metodi computazionali per valutare l’instabilità dei microsatelliti, quindi i protocolli degli studi spesso specificano quali piattaforme o algoritmi sono accettabili.^[7] Questo livello di dettaglio garantisce che tutti i pazienti arruolati nello studio abbiano veramente le caratteristiche molecolari che il trattamento è progettato per colpire.

Il campione di tessuto utilizzato per il test deve soddisfare determinati standard di qualità per l’arruolamento nello studio. Il contenuto tumorale, cioè la percentuale di cellule tumorali nel campione, tipicamente deve essere abbastanza alto per garantire risultati accurati, spesso almeno il 20 percento di cellule tumorali. Il tessuto deve anche essere adeguatamente conservato, di solito come blocchi fissati in formalina e inclusi in paraffina, che è il metodo standard per conservare i campioni bioptici e chirurgici.^[7] Il tessuto fresco è talvolta preferito per alcuni metodi di test avanzati, ma questo è meno comune perché richiede una manipolazione speciale e un’elaborazione immediata.

I risultati da tessuto linfonodale, cioè cancro che si è diffuso ai linfonodi, o da tessuto metastatico possono essere utilizzati per il test dell’instabilità dei microsatelliti negli studi clinici, non solo il tumore primario. Questa flessibilità è importante perché lo stato di instabilità dei microsatelliti è generalmente coerente in tutta la malattia del paziente, sia che si testi il tumore originale o le aree dove il cancro si è diffuso.^[8] Ciò significa che anche se il tumore primario non è più disponibile per il test, i campioni da altri siti tumorali possono fornire le informazioni necessarie per la qualificazione allo studio.

La tempistica per ottenere i risultati dei test è un’altra considerazione pratica per l’arruolamento negli studi clinici. I risultati dell’immunoistochimica tipicamente diventano disponibili entro pochi giorni o una settimana dopo che il campione di tessuto raggiunge il laboratorio. Il test basato sulla PCR può richiedere un po’ più di tempo, spesso da una a due settimane. Il sequenziamento di nuova generazione generalmente richiede da due a tre settimane o talvolta più a lungo, a seconda della complessità dell’analisi e del flusso di lavoro del laboratorio.^[7] I pazienti e i medici devono tenere conto di questi tempi quando considerano la partecipazione allo studio, specialmente se il trattamento deve iniziare rapidamente.

Alcuni studi clinici stanno investigando se il test di marcatori aggiuntivi, come il carico mutazionale tumorale (TMB), possa aiutare a prevedere quali pazienti con instabilità dei microsatelliti risponderanno meglio al trattamento. Il carico mutazionale tumorale si riferisce al numero totale di mutazioni presenti nel DNA tumorale. I tumori con alta instabilità dei microsatelliti tendono ad avere un carico mutazionale tumorale elevato perché il sistema di riparazione del DNA difettoso permette a molti errori di accumularsi.^[9] Quando entrambe le caratteristiche sono presenti, il cancro può essere particolarmente vulnerabile all’immunoterapia. Tuttavia, il test del carico mutazionale tumorale non è ancora un requisito standard per la maggior parte degli studi focalizzati sull’instabilità dei microsatelliti.